Medsocium.com

Соколов А.В., Пулина М.О., Кристиян А.В., Захарова Е.Т., Васильев В.Б. ГУ НИИ Экспериментальной Медицины РАМН, Санкт-Петербург Церулоплазмин (ЦП, ферро-О2-оксидоредуктаза) – медьсодержащая оксидаза плазмы крови, белок острой фазы воспаления. Благодаря наличию нескольких ферментативных активностей (ферроксидаза, купроксидаза, супероксиддисмутаза, глутатион-зависимая пероксидаза) ЦП препятствует образованию активных форм кислорода. ЦП используется в терапии как антиоксидант, стимулятор гемопоэза при иммунодепрессии и интоксикации. Взаимодействуя с другими белками, ЦП приобретает новые функции. Так, взаимодействие ЦП с миелопероксидазой (МПО), приводящее к ингибированию ее прооксидантной активности, было открыто в 1997 году группой Segelmark et al. Нашей группой было открыто взаимодействие ЦП с лактоферрином (ЛФ), трансферрином молока, экзокринных секретов и гранул нейтрофилов. Данный комплекс был обнаружен in vivo при инъекции ЛФ человека в кровяное русло крыс, а также в грудном молоке и слезной жидкости. Поскольку ЛФ и МПО являются белками нейтрофилов, нашей целью было изучение комплексообразования ЦП с белками нейтрофилов и скрининг наличия таких комплексов в крови больных с гнойной патологией. Вначале мы определили белки-мишени для взаимодействия с ЦП среди нейтрофильных белков. Для этого мы использовали аффинную хроматографию нейтрофильного экстракта на иммобилизованном ЦП (ЦП-Сефароза). Оказалось, что кроме ЛФ и МПО, с ЦП взаимодействуют нейтрофильная эластаза и азуроцидин (САР 37, гомолог эластазы без активности протеиназы). Данные белки были определены с помощью анализа N-концевой аминокислотной последовательности и масс-спектрометрии фрагментов трипсинолиза. Этим же методом мы обнаружили, что частично очищенный из крови ЦП содержит примесь комплекса ЦП-МПО, сорбирующуюся на Гепарин-Сефарозе. В экспериментах по аффинной хроматографии ЛФ и МПО на ЦП-Сефарозе мы не наблюдали конкуренции данных белков за связывание с иммобилизованным ЦП. Это позволило предположить существование тройного комплекса ЦП-ЛФ-МПО. Методом диск-электрофореза, мы изучали изменение подвижности ЦП, обусловленное массой и зарядом белка при комплексообразовании. Добавление к ЦП очищенных ЛФ, МПО и смеси ЛФ и МПО вызывало ретардацию зоны ЦП, выявляемой после электрофореза в полиакриламидном геле при окраске хромогенным субстратом – о-дианизидином (Рис. 1). Используя этот метод, мы впервые обнаружили комплексы ЦП-ЛФ (подвижность В), ЦП-МПО (подвижность А) и ЦП-ЛФ-МПО (зона на старте) при патологии in vivo, анализируя биологические жидкости: в сыворотке крови 40 больных с гнойными поражениями конечностей, в лаваже 2-х больных с абсцессами в легких, в плевральной жидкости 2-х больных туберкулезом, и в 2-х из 30 вагинальных секретов с подозрением на микробные инфекции. Электрофорез этих образцов показал наличие, наряду с основной зоной ЦП сыворотки (подвижность С), дополнительных зон с меньшей подвижностью. Данные зоны исчезали при добавлении к образцам антител к ЛФ и МПО (Рис. 1, 6 и 7). Рис. 1. Выявление ЦП при диск-электрофорезе в полиакриламидном геле (окраска о-дианизидином) образцов: 1 – сыворотки крови здорового донора (5 мкл), 2 – 1+ ЛФ (0,5 мкг), 3 – 1+ МПО (1 мкг), 4 – 1+ ЛФ (0,5 мкг) и МПО (1 мкг), 5 – сыворотка больной А. с абсцессом плеча (5 мкл), 6 – 5 + антитела к ЛФ, 7 – 5 + антитела к МПО. При диск-электрофорезе образцов сыворотки млекопитающих 7 видов, к которым добавили МПО человека, наблюдалась ретардация ЦП. Что говорит об отсутствии видоспецифичности при образовании комплекса ЦП-МПО. Такие же результаты были получены нами ранее при изучении комплексообразования между ЦП и ЛФ разных видов млекопитающих. При введении 2 мг МПО человека в кровяное русло крыс весом 150 г, мы наблюдали, что по мере уменьшения концентрации МПО, гетерогенный комплекс ЦП крысы - МПО человека исчезал из циркуляции в течение 30 минут. При инъекции кроликам внутрикожно в параспинальную область полного адъюванта Фрейнда и суспензии полиакриламидного геля (моделирование гнойного воспаления), мы наблюдали в сыворотке крови ЦП с ретардацией, подобной комплексам ЦП-МПО человека и ЦП-ЛФ человека при диск-электрофорезе. При отборе проб сыворотки у кроликов, данные комплексы выявлялись на следующий день после инъекции, что сопровождалось повышением содержания ЦП в сыворотке в 2 раза. Таким образом, появление комплексов ЦП с белками нейтрофилов (ЦП-ЛФ, ЦП-МПО и ЦП-ЛФ-МПО) в крови и других биологических жидкостях, может служить одним из показателей функциональной активности нейтрофилов и использоваться для диагностики гнойных воспалений. Исследование выполнено при поддерже грантов РФФИ № 05-04-48765 и Н.Ш. 1730.2003.4.