Medsocium.com

Ніколаєнко І.В., Галкін О.Ю., Раєвська Г.Є, Донська Є.С. АТЗТ НВК «ДіаПрофМед», НТЦ Імунобіотехнології НТК «Інститут монокристалів» НАН України Ррозвиток методів серодіагностики обумовлює постійне підвищення вимог до чутливості та специфічності тест-систем, а отже і до якості їх компонентів, зокрема моноклональних антитіл (МКАТ). Питання вдосконалення діагностичних наборів на вірусний гепатит В (ВГВ) залишається особливо актуальним. Збільшення показника чутливості тесту до 0,1 – 0,5 нг HBs-антигену на мл не має призводити до зниження специфічності аналізу. Вирішення даного завдання можливе за рахунок: одержання нових МКАТ для «сендвіч»-варіанту ТІФА; підбору більш вдалих пар МКАТ; удосконалення імуноферментних кон’югатів; оптимізації умов проведення аналізу. Реалізація першого напрямку пов’язана з: 1) одержанням HBs-антигену високого ступеню чистоти; 2) відпрацюванням схем імунізації, що забезпечують високий вихід позитивних клонів гібридом; 3) оптимізацією методів тестування та відбору гібридом, які продукують високоактивні та специфічні МКАТ. Джерелом нативного HBs-антигену є сироватка крові людей інфікованих ВГВ. Більшість методик одержання HBs-антигену, що базуються на його фізико-хімічних властивостях, досить складні та багато етапні, а також потребують значних об’ємів сироватки. Наші дослідження довели низьку ефективність зазначених методів. Проведені експерименти спонукали до використання імуноафінної хроматографії, як високоефективного методу виділення вірусних антигенів. Окрім HBs-антигену, одержаного за оригінальною схемою, для імунізації використовували HBs-антиген виробництва «Chemicon» (США) та «ИмБио» (Росія). Імунізацію мишей лінії Balb/c проводили за двома принципово різними схемами – довгостроковій та короткостроковій. З використанням даних схем було проведено 14 гібридизацій та одержано більше 200 позитивних клонів гібридом. Підвищення ефективності одержання та відбору практично значущих клонів можливе за рахунок вдосконалення та оптимізації методик імунізації мишей і тестування гібридом. А це вимагало адаптації схеми ТІФА для відбору МКАТ, придатних для використання у якості кон’югату або імуносорбенту, а також модифікації схем імунізації мишей з метою підвищення ролі необхідних епітопів HBs-антигену при імунній відповіді. Найбільш простим способом визначення епітопної спрямованості одержаних МКАТ є їх порівняння із комерційними аналогами. Для цього зручно використовувати конкурентний варіант ТІФА. Так був відібраний клон 95Е1, який за специфічністю переважав комерційний аналог NF5. Даний підхід добре зарекомендував себе при підборі МКАТ для імуноферментного кон’югату. Проте така схема не виправдала себе при відборі МКАТ для імуносорбенту, тому для вирішення даної задачі одержані МКАТ тестували у модифікованому «сендвіч»-варіанті ТІФА. Роботи по відбору МКАТ для імуносорбенту ще не завершені. Використання модифікованого «сендвіч»-варіанту ТІФА дозволяє значно прискорити відбір гібридом, минаючи тривалий етап клонування та одержання асцитичної рідини – аналізуються лише ті клони, МКАТ яких виявляють активність у даній схемі ТІФА. Підвищення ефективності одержання придатних для серодіагностики клонів проводили не тільки шляхом оптимізації їх відбору, а й модифікацією схем імунізації тварин. З цією метою імунізацію мишей проводили комплексом «антиген-антитіло». Роботи по аналізу одержаних таким чином клонів гібридом тривають.