Medsocium.com

Донська Є.С., Раєвська Г.Є., Ніколаєнко І.В., Терещенко М.І, Гураль А.Л. АТЗТ НВК “Діапроф Мед”, НТЦ Імунобіотехнології НТК “Інститут монокристалів” НАН України Гепатит В (ГВ) до теперішнього часу залишається актуальною проблемою сучасної науки та охорони здоров’я в усьому світі та в Україні зокрема. Це визначається широким розповсюдженням цієї інфекції, високим рівнем захворюваності, тяжким перебігом, а також схильністю до формування хронічних уражень печінки – хронічного гепатиту, цирозу печінки та гепатоцелюлярної карциноми. До теперішнього часу одним з основних методів специфічної діагностики ГВ залишається виявлення поверхневого антигену вірусу. Найбільш поширеним варіантом для визначення HBsAg є так званий “сендвіч” з антитіл (імобілізовані антитіла-антиген-антитіла), що і був взятий нами за основу при створенні тест-системи для визначення HBsAg. Метою даної роботи було отримати кон’югати на основі моноклональних антитіл до HBsAg та використати їх у імуноферментній тест-системі для діагностики гепатиту В. Для отримання гібридоми, що продукує специфічні до HBsAg моноклональні антитіла, було проведено 6 гібридизацій та отримано більше 200 клонів гібридом, синтезуючих МКАТ до HBsAg. За результатами тестування був відібраний клон 95Е1. Чутливість ІФА при використанні кон’югату цього клону МКАТ за стандартами ОСО-HbsAg (Росія), СО-HbsAg (Білорусь), ad-HbsAg (Chemicon, США) та ay-HBsAg (Chemicon, США) складала 0,25 нг/мл, 0,2 нг/мл, 0,35 нг/мл та 0,25 нг/мл, відповідно, що навіть перевищувало чутливість аналізу з кон’югатом NF5 (“Сорбент- Сервис”, Росія). В подальших дослідженнях нами була проведена робота щодо підвищення чутливості ІФА для виявлення HBsAg у напрямку оптимізації методу кон’югування. Згідно літературних даних, застосування полімерної пероксидази у складі кон’югатів забезпечує більш високий ступінь ампліфікації сигналу. Найчастіше для полімеризації білків застосовують гомо- та гетеробіфункціональні перехреснозшиваючі реагенти. Нами були проведені порівняльні дослідження кон’югату МКАТ клону 95Е1 з мономерною та полімерною пероксидазою, отриманого за оригінальною методикою, і встановлено, що при використанні кон’югату з полімерною пероксидазою чутливість за всіма стандартами підвищувалася і складала для ОСО-HbsAg - 0,2 нг/мл, СО-HBsAg - 0,1 нг/мл, ay-HBsAg –0,3 нг/мл та ad-HBsAg – 0,2 нг/мл, відповідно. Специфічність ІФА при використанні 400 зразків сироваток в дослідженнях складала 99,8%. Висока чутливість ІФА для визначення HBsAg необхідна для виявлення мінімальних концентрацій поверхневого антигену у сироватці (0,1-0,5 нг/мл), що притаманно ранньому етапу інфекції. Але у деяких пацієнтів концентрація HBsAg у крові може досягати 200 мкг/мл та більше. Такі високі концентрації HBsAg перешкоджають утворенню “сендвіча” у ІФА, що призводить до зниження виявлення антигену (“hook”- ефект високих доз). Нами було досліджено 7 зразків сироваток крові, в яких концентрація HBsAg знаходилась у межах 200-500 мкг/мл. Значення оптичної густини (ОГ) цільних зразків в ІФА при використанні кон’югату мономерної пероксидази знаходилось у діапазоні 0,7-1,5 оптичних одиниць (ОО) і підвищувалася до 2,5-3,0 при розведенні, в той час як використання полімерної пероксидази в кон’югаті забезпечувало підвищення ОГ цільних зразків до 2,3-3,0 ОО. Тобто, застосування кон’югату 95Е1 з полімерною пероксидазою в імуноферментній тест-системі для виявлення поверхневого антигену вірусу гепатиту В дозволяє знизити вплив “hook” - ефекту високих доз при визначенні HBsAg у сироватках крові та одночасно підвищити чутливість аналізу. Таким чином, нами отримано ряд високореагуючих клонів МКАТ проти HBsAg та синтезовано на їх основі пероксидазні кон’югати. Внаслідок проведення порівняльного аналізу встановлено, що кон’югат МКАТ клону 95Е1 забезпечував найкращі показники інформативності в ІФА, а додаткова полімеризація пероксидази у складі кон’югату дозволила підвищити межу чутливості ІФА та забезпечила усунення hook-ефекту високих доз.